Postupak mrlja od grama u mikrobiologiji

Mrlja po Gramu različita je metoda bojenja koja se koristi za dodjeljivanje bakterija jednoj od dvije skupine (gram-pozitivna i gram-negativna) na temelju svojstava njihove stanične stijenke. Poznata je i po Gramovoj obojenosti ili Gramovoj metodi. Postupak je imenovan po osobi koja je razvila tehniku, danski bakteriolog Hans Christian Gram.

Postupak se temelji na reakciji peptidoglikana u staničnim zidovima nekih bakterija. Mrlja po Gramu uključuje bojenje bakterija, fiksiranje boje mordantom, dekoloriranje stanica i nanošenje kontrasta.

1. Primarna mrlja (kristalno ljubičasta) veže se na peptidoglikan, obojajući stanice ljubičasto. I gram-pozitivne i gram-negativne stanice imaju peptidoglikan u staničnoj stijenci, tako da u početku sve bakterije oboje ljubičasto.
2. Gramov jod (jod i kalijev jodid) primjenjuju se kao mordant ili fiksativ. Gram-pozitivne stanice tvore kristalno ljubičasti jodni kompleks.
3. Alkohol ili se aceton koristi za dekoloriranje stanica. Gram-negativne bakterije imaju mnogo manje peptidoglikana u staničnoj stijenci, tako da ih je ovaj korak u osnovi bezbojan, dok su samo neke boje uklonjene iz gram-pozitivnih stanica koje imaju više peptidoglikana (60-90% stanične stijenke). Debela stanična stijenka gram-pozitivnih stanica dehidrira se korakom uklanjanja boje, uzrokujući da se skupljaju i zadržavaju kompleks mrlja-jod iznutra.
   instagram viewer
4. Nakon koraka uklanjanja boje, nanosi se kontrasta (obično safranin, ali ponekad i fuksin) za obojenje bakterija u ružičasto. I gram-pozitivne i gram-negativne bakterije skupljaju ružičastu mrlju, ali nije vidljiva preko tamnije ljubičaste gram-pozitivne bakterije. Ako se postupak bojenja izvede pravilno, gram-pozitivne bakterije će biti ljubičaste, dok gram-negativne bakterije će biti ružičaste.

Rezultati mrlje po Gramu se pregledavaju pomoću svjetlosne mikroskopije. Budući da su bakterije obojene, ne samo da je identificirana njihova skupina mrlja po Gramu, već njihov oblikmože se primijetiti uzorak, veličina i skup obrasca. To mrlju po Gramu čini vrijednim dijagnostičkim alatom za medicinsku kliniku ili laboratorij. Iako mrlja ne može definitivno identificirati bakterije, često je poznato je li gram-pozitivno ili gram negativno dovoljno za propisivanje učinkovitog antibiotika.

Neke bakterije mogu biti gram-varijabilne ili gram-neodređene. Međutim, čak i ove informacije mogu biti korisne u sužavanju bakterijskog identiteta. Tehnika je najpouzdanija kada su kulture starije od 24 sata. Iako se može upotrebljavati na kulturama juha, najbolje ih je prvo centrifugirati. Primarno ograničenje tehnike je da daje pogrešne rezultate ako se u tehnici naprave greške. Za postizanje pouzdanog rezultata potrebna je praksa i vještina. Također, zarazni uzročnik možda nije bakterijski. Eukariotski patogeni mrlje gram-negativno. Međutim, većina eukariotske stanice osim što se gljive (uključujući kvas) tijekom postupka ne pridržavaju klizača.

• Kristalna ljubičica (primarna mrlja)
• Gramov jod (mješan, za fiksiranje kristalne ljubičice u staničnoj stijenci)
• Etanol ili aceton (sredstvo za obezbojivanje)
• Safranin (sekundarna mrlja ili kontrasta)
• Voda u bočici sa kapaljkom ili bočicom s kapaljkom
• Kliznici mikroskopa
• Složeni mikroskop

1. Na slajd stavite malu kap uzorka bakterija. Toplina fiksira bakterije na toboganu triput ga prolazeći kroz plamen Bunsenovog plamenika. Primjenjujući previše topline ili predugo, može se rastopiti stanični zid bakterija, narušavajući njihov oblik i dovesti do netočnih rezultata. Ako se nanese premalo topline, bakterije će isprati tobogan tijekom bojenja.
2. Pomoću kapaljke nanesite primarnu mrlju (kristalno ljubičastu) na klizač i ostavite je da sjedi 1 minutu. Klizno lagano isperite vodom ne duže od 5 sekundi kako biste uklonili suvišne mrlje. Predugo ispiranje može ukloniti previše boje, a ako se ne ispire dovoljno dugo, može dopustiti da previše mrlja ostane na gram-negativnim stanicama.
3. Pomoću kapaljke nanesite Gramov jod na klizač da fiksirate kristalnu ljubičicu na staničnoj stijenci. Ostavite da odstoji 1 minutu.
4. Staklenku isperite alkoholom ili acetonom oko 3 sekunde, a zatim odmah laganim ispiranjem vodom. Gram-negativne stanice će izgubiti boju, dok će gram-pozitivne stanice ostati ljubičaste ili plave boje. Međutim, ako se dekolorizator ostane predugo, sve će stanice izgubiti boju!
5. Nanesite sekundarnu mrlju, safranin i ostavite da odstoji 1 minutu. Nježno isperite vodom ne duže od 5 sekundi. Gram-negativne stanice trebaju biti obojene crveno ili ružičasto, dok će gram-pozitivne stanice i dalje izgledati ljubičasto ili plavo.
6. Pregledajte dijapozitiv pomoću složenih mikroskopa. Uvećavanje može biti potrebno od 500x do 1000x radi razlikovanja oblika i rasporeda stanica.

Nisu sve bakterije identificirane bojom po Gramu povezane s bolestima, ali nekoliko važnih primjera uključuje:

• Gram-pozitivni koki (okrugli):Staphylococcus aureus
• Gram-negativni koki:Neisseria meningitidis
• Gram-pozitivne bacile: Bacillus anthracis
• Gram-negativni bacili:Escherichia coli