TBE pufer (Tris-borat-EDTA) je puferska otopina koja se sastoji od Tris baze, borove kiseline i EDTA (etilendiaminetetraoctene kiseline). Taj se pufer često koristi za elektroforezu gela agaroze u analizi DNA proizvoda koji su rezultat PCR amplifikacije, protokola pročišćavanja DNK ili eksperimenta kloniranja DNA.
TBE uporabe
TBE pufer je posebno koristan za odvajanje manjih fragmenata DNK (MW <1000), kao što su mali proizvodi od restrikcijski enzim probavlja. TBE ima veći kapacitet puferiranja i dat će oštrije razlučivosti od TAE pufera. TAE (Tris-acetat-EDTA) pufer je otopina koju čine Tris baza, octena kiselina i EDTA.
TBE je općenito skuplje od TAE i inhibira DNA ligazu, što može uzrokovati probleme ako su namijenjeni daljnji koraci pročišćavanja i ligacije DNA. S tri jednostavna koraka koja slijede naučite kako napraviti TBE međuspremnik. Za stvaranje ne bi trebalo biti više od oko 30 minuta.
Što trebaš
Da biste napravili TBE pufer, trebat će vam samo četiri tvari. Preostali predmeti na ovom popisu su oprema. Četiri potrebne tvari su dinatrijeva sol EDTA, Tris baza, borna kiselina i deionizirana voda.
Što se opreme tiče, trebat će vam pH-mjerač i standardi kalibracije, prema potrebi. Uz to, trebat ćete nekih 600-mililitarskih i 1500-mililitarskih čaša ili tikvica. Zaokruživanjem vaših potreba oprema su graduirani cilindri, miješalice i pločice za miješanje.
Provjerite inventar u laboratoriju koji ćete koristiti kako biste bili sigurni da imate sve što vam je potrebno prije nego što započnete. Ništa gore od zaustavljanja usred pripreme rješenja jer vam je ponestalo materijala.
Ako je vaš laboratorij u školi ili na vašem radnom mjestu, provjerite da li ima sve predmete na zalihi. Ako to učinite, na kraju ćete uštedjeti vrijeme i energiju.
Težina formule skraćeno je kao FW. To je atomska težina elementa pomnožena s brojem atoma svakog elementa u formuli, a zatim zbrajanje svih masa svakog elementa zajedno.
Stock rješenje EDTA
Rješenje EDTA-e treba pripremiti prije vremena. EDTA neće potpuno ući u otopinu dok se pH ne prilagodi na oko 8,0. Za osnovnu otopinu od 500 mililitara od 0,5 M EDTA, izvažite 93,05 grama dinatrijeve soli EDTA (FW = 372,2). Zatim je otopite u 400 mililitara deionizirane vode i podesite pH s NaOH (natrijevim hidroksidom). Nakon toga, otopinu dopunite do konačnog volumena od 500 mililitara.
Stock rješenje TBE
Napravite koncentriranu (5x) osnovnu otopinu TBE vaganjem 54 grama Tris baze (FW = 121,14) i 27,5 grama borne kiseline (FW = 61,83) i otapa se u oko 900 mililitara deionizirane voda. Zatim dodajte 20 mililitara 0,5 M (molarnost ili koncentracija) EDTA (pH 8,0) i otopinu namjestite na konačni volumen od 1 litre. Ova se otopina može čuvati na sobnoj temperaturi, ali u starijim otopinama će se stvoriti talog. Spremnik pohranite u staklene boce i odbacite ako se stvorio talog.
Radno rješenje TBE-a
Za elektroforezu gela agaroze može se upotrijebiti TBE pufer u koncentraciji 0,5x (razrjeđivanje koncentrirane mase 1:10). Osnovnu otopinu razrijedite 10 puta u deioniziranoj vodi. Konačne koncentracije rastvora su 45 mM tris-borat i 1 mM (milimolarni) EDTA. Tampon je sada spreman za upotrebu u trčanje gela od agaroze.