Polje od biotehnologija jedna je od stalnih promjena. Brzi rast i razvoj vrhunskih istraživanja ovise o inovativnosti i kreativnosti znanstvenici i njihova sposobnost da u osnovnoj molekularnoj tehnici vide potencijal i primijene ga na novom procesi. Pojava lančane reakcije polimeraze (PCR) otvorio je mnoga vrata u genetskim istraživanjima, uključujući sredstva za DNK analiza i identifikacija različitih gena na temelju njihovih DNK sekvenata. Redoslijed DNK-a također ovisi o našoj sposobnosti korištenja gel elektroforeza odvojiti lance DNA koje se razlikuju po veličini za samo jedan osnovni par.
Sekvenciranje DNK
U kasnim 1970-ima izumljene su dvije tehnike sekvenciranja DNK za duže molekule DNK: metoda Sanger (ili dideoksi) i metoda Maxam-Gilbert (kemijsko cijepanje). Maxam-Gilbertova metoda temelji se na nukleotidnom odvajanju kemikalijama i najbolje se koristi za sekvenciranje oligonukleotida (kratki nukleotidni polimeri, obično dulji od 50 parova baza). Sanger metoda se češće koristi iz razloga što je tehnički lakše dokazano i, s Pojavom PCR-a i automatizacijom tehnike, lako se primjenjuje na duge niti DNA, uključujući neke cijele geni. Ova se tehnika temelji na prekidu lanca dideoksinukleotidima tijekom PCR reakcija produljenja.
Sanger metoda
U metodi Sanger, DNA lanac koji se analizira koristi se kao obrazac, a DNA polimeraza koristi se u PCR reakciji za stvaranje komplementarnih lanaca pomoću prajmera. Pripremljene su četiri različite PCR reakcijske smjese, a svaka sadrži određeni postotak analoga dideoksinukleozid trifosfata (ddNTP) na jedan od četiri nukleotida (ATP, CTP, GTP ili TTP).
Sinteza novog lanca DNA traje sve dok jedan od tih analoga nije ugrađen, u koje vrijeme je lan prerano skraćen. Svaka PCR reakcija će sadržavati mješavinu različitih duljina DNA, a sve se završava nukleotidom koji je dideoksi označen za tu reakciju. Gel elektroforeza se zatim koristi za odvajanje niti četiriju reakcija u četiri odvojene trake i određivanje redoslijeda izvornog obrasca na temelju koje duljine lanaca završavaju nukleotidom.
U automatiziranoj Sangerovoj reakciji koriste se temeljni premazi koji su označeni s četiri različite fluorescentne oznake u boji. PCR reakcije, u prisutnosti različitih dideoksinukleotida, provode se kao što je gore opisano. Međutim, nakon toga se četiri reakcijske smjese kombiniraju i nanose na jednu traku gela. Boja svakog fragmenta detektira se laserskim snopom, a informacije prikuplja računalo koji stvara kromatograme koji prikazuju vrhove za svaku boju, iz čega se može nalaziti slijed DNA predloška odrediti.
Obično je metoda automatiziranog sekvenciranja točna samo za sekvence duljine do oko 700-800 baznih parova. Međutim, moguće je dobiti pune sekvence većih gena i, zapravo, čitavih genoma, postupnim postupcima kao što su Primer Walking i Shotgun sekvenciranje.
U Primernom hodanju, izvedivi dio većeg gena sekvenciran je metodom Sanger. Novi prajmeri nastaju iz pouzdanog segmenta sekvence i koriste se za nastavak sekvenciranja dijela gena koji je bio izvan raspona izvornih reakcija.
Sekvenciranje pušaka podrazumijeva nasumično presijecanje DNK segmenta koji je zanimljiv na prikladnije (upravljane) fragmente veličine, redoslijedom svakog fragmenta i rasporedom dijelova na temelju preklapanja sekvenci. Ovu je tehniku olakšala primjena računalnog softvera za organiziranje dijelova koji se preklapaju.