Restriktivni endonuklezi su klasa enzim koje režu molekule DNK. Svaki enzim prepoznaje jedinstvene sekvence nukleotida u lancu DNA - obično su dugačke oko četiri do šest parova baza. Nizovi su palindromni time što komplementarni lanac DNA ima istu sekvencu u obrnutom smjeru. Drugim riječima, oba lanca DNA sječe se na istom mjestu.
Gdje se nalaze ovi enzimi
Restriktivni enzimi nalaze se u mnogim različitim sojevima bakterija gdje je njihova biološka uloga sudjelovati u obrani stanica. Ti enzimi ograničavaju stranu (virusnu) DNK koja ulazi u stanice uništavajući ih. Stanice domaćina imaju sustav za modifikaciju restrikcije koji metilira vlastiti DNK na mjestima specifičnim za njihove restriktivne enzime, štiteći ih od cijepanja. Više od 800 poznati enzimi otkrivene su više od 100 različitih nukleotidnih sekvenci.
Vrste restrikcijskih enzima
Postoji pet različitih vrsta restrikcijskih enzima. Tip I reže DNK na nasumičnim mjestima od 1.000 ili više parova baza od mjesta prepoznavanja. Tip III seče s približno 25 parova baza s mjesta. Obje ove vrste zahtijevaju ATP i mogu biti veliki enzimi s više podjedinica. Enzimi tipa II, koji se pretežno koriste u biotehnologiji, režu DNK unutar prepoznatog slijeda bez potrebe za ATP-om i manji su i jednostavniji.
Restriktivni enzimi tipa II imenovani su prema bakterijskim vrstama iz kojih su izolirani. Na primjer, enzim EcoRI izoliran je iz E. coli. Većina javnosti je poznata s E. izbijanje koliba u hrani.
Zaštitni enzimi tipa II mogu stvoriti dvije različite vrste posjekotina, ovisno o tome da li su oba rezli konce u središtu raspoznavajućeg niza ili svaki pramen bliže jednom kraju prepoznavanja slijed.
Prethodni rez će stvoriti "tupim krajevima" bez nukleotidnih preklopa. Potonji stvara "ljepljive" ili "kohezivne" krajeve, jer svaki rezultirajući fragment DNA ima prekrivač koji nadopunjuje ostale fragmente. Oboje su korisni u molekularnoj genetici za izradu rekombinantni DNA i proteina. Ovaj oblik DNK se ističe jer nastaje vezanjem (spajanjem) dvaju ili više različitih niti koje prvotno nisu bile spojene.
Enzimi tipa IV prepoznaju metiliranu DNK, a enzimi tipa V koriste RNK za rezanje sekvenci na invazivnim organizmima koji nisu palindromski.
Primjena u biotehnologiji
Restriktivni enzimi koriste se u biotehnologiji za rezanje DNK na manje niti kako bi se proučile razlike u dužini fragmenata među pojedincima. To se naziva polimorfizmom duljine restrikcije (RFLP). Koriste se i za kloniranje gena.
RFLP tehnike rabljeni su za utvrđivanje da jedinke ili skupine jedinki imaju karakteristične razlike u sekvencijama gena i obrascima cijepanja restrikcije u određenim područjima genoma. Poznavanje ovih jedinstvenih područja temelj je za DNK otisci prstiju. Svaka od ovih metoda ovisi o upotrebi elektroforeza agaroznog gela za odvajanje fragmenata DNA. TBE pufer, koji se sastoji od Tris baze, borne kiseline i EDTA, obično se koristi za agarozni gel elektroforeza ispitati proizvode DNA.
Upotreba u kloniranju
Kloniranje često zahtijeva umetanje gena u plazmid, koji je vrsta komada DNK. Restriktivni enzimi mogu pomoći u postupku zbog jednostrukih pregrada koje ostavljaju prilikom rezanja. DNA ligaza, zasebni enzim, može spojiti dvije molekule DNK s odgovarajućim krajevima.
Dakle, pomoću restrikcijskih enzima sa enzimima DNK ligaza, komadići DNK iz različitih izvora mogu se upotrijebiti za stvaranje jedne molekule DNK.