PCR zalaže se za lančana reakcija polimeraze, molekularna biološka tehnika za amplifikaciju segmenata DNA, generiranjem višestrukih kopija pomoću enzima DNK polimeraze u kontroliranim uvjetima. Samo jedna kopija DNK segmenta ili gena može se klonirati u milijune primjeraka, omogućujući otkrivanje pomoću boja i drugih tehnika vizualizacije.
Razvijen 1983. godine, proces PCR-a omogućio je njegovo obavljanje Sekvence DNA te identificirati redoslijed nukleotida u pojedinim genima. Metoda koristi termički ciklus ili opetovano zagrijavanje i hlađenje reakcije za topljenje i umnožavanje DNA. Kako PCR nastavlja, "nova" DNA koristi se kao predložak za replikaciju i nastaje lančana reakcija, eksponencijalno pojačavajući DNK obrazac.
PCR tehnike primjenjuju se u mnogim područjima biotehnologije, uključujući proteinski inženjering, kloniranje, forenzika (otisak DNK-a), testiranje očinstva, dijagnoza nasljednih i / ili zaraznih bolesti i za analiza ekoloških uzoraka.
Za forenziku je PCR osobito koristan jer povećava i najmanju količinu DNK dokaza. PCR se također može koristiti za analizu DNA stare tisuće godina, a ove se tehnike koriste za identifikaciju svega, od mamuta starog 800 000 do mumija iz cijelog svijeta.
PCR postupak
Inicijalizacija
Ovaj korak je potreban samo za DNK polimeraze za koje je potreban PCR s vrućim startom. Reakcija je zagrijana na temperaturu između 94 i 96 ° C i održavana 1-9 minuta.
denaturacije
Ako postupak ne zahtijeva inicijalizaciju, denaturacija je prvi korak. Reakcija se zagrijava na 94-98 ° C 20-30 sekundi. Vodikove veze DNK predloška su poremećene i nastaju jednolančane molekule DNK.
prekaljivanje
Reakcijska temperatura je niža između između 50 i 65 ° C i održavana je 20-40 sekundi. Primeri se angeliraju na jednolančane DNK šablone. Temperatura je izuzetno važna tijekom ovog koraka. Ako je prevruće, temeljni premaz se možda neće vezati. Ako je previše hladno, temeljni premaz može se vezati nesavršeno. Dobra veza nastaje kada redoslijed primera usko odgovara sekvenci predloška.
Proširenje / Istezanje
Temperatura tijekom ovog koraka varira ovisno o vrsti polimeraze. DNA polimeraza sintetizira potpuno novi lanac DNA.
Završno produženje
Ovaj se korak izvodi na 70-74 ° C 5-15 minuta nakon posljednjeg PCR ciklusa.
Konačno zadržavanje
Ovaj korak nije obavezan. Temperatura se održava na 4-15 ° C i zaustavlja reakciju.
Tri faze PCR postupka
Eksponencijalno pojačavanje
Tijekom svakog ciklusa, udvostručuje se proizvod (specifični dio DNK koji se replicira).
Stupanj za izravnavanje
Kako DNK polimeraza gubi aktivnost i troši reagense, reakcija se usporava.
Plato
Više se proizvoda ne akumulira.