Kako lančana reakcija polimeraze djeluje na pojačavanje gena

Lančana reakcija polimeraze (PCR) je molekularno genetska tehnika izrade višestrukih kopija gena i također je dio procesa sekvenciranja gena.

Genske kopije izrađene su korištenjem uzorka DNK, a tehnologija je dovoljno dobra da se iz jedne kopije gena koji se nalazi u uzorku napravi više kopija. PCR amplifikacija gena u milijunima kopija omogućuje otkrivanje i identifikaciju genske sekvence pomoću vizualnih tehnika na temelju veličine i naboja (+ ili -) dijela DNK.

U kontroliranim uvjetima, mali segmenti DNA nastaju enzimima poznatim kao DNK polimeraze, koji dodaju besplatne deoksinenukleotide (dNTP) na dio DNA poznat kao "predložak". Čak i manji dijelovi DNK, nazvani "primeri" koriste se kao polazna točka za polimeraze.

Primeri su mali umjetni dijelovi DNK (oligomeri), obično dugi između 15 i 30 nukleotida. Stvoreni su znanjem ili nagađanjem kratkih nizova DNK na samim krajevima gena koji se amplificira. Tijekom PCR-a, DNA koja se sekvencira zagrijava se, a dvostruke niti se odvajaju. Nakon hlađenja, temeljni premazi se vežu na predložak (koji se naziva žarenje) i stvaraju mjesto za početak polimeraze.

Polimerna lančana reakcija (PCR) omogućena je otkrićem termofila i termofila enzima polimeraze (enzimi koji održavaju strukturni integritet i funkcionalnost nakon zagrijavanja pri visokim temperature). Koraci u PCR tehnici su sljedeći:

• Stvara se smjesa s optimiziranim koncentracijama DNA uzorka, enzimom polimeraze, prajmerima i dNTP-om. Sposobnost zagrijavanja smjesa bez denaturiranja enzima omogućava denaturaciju dvostruke spirale uzorka DNA pri temperaturama u rasponu od 94 stupnja Celzija.
• Nakon denaturacije, uzorak se hladi do umjerenijeg raspona, oko 54 stupnja, što olakšava žarenje (vezanje) primera za jednolančane šablone DNA.
• U trećem koraku ciklusa uzorak se ponovo zagrijava na 72 stupnja, što je idealna temperatura za Taq DNA polimerazu za produženje. Tijekom izduživanja, DNA polimeraza koristi originalni pojedinačni lanac DNA kao predložak za dodavanje komplementarnih dNTP-ova do 3 'kraja svakog primerka i generiraju presjek dvolančane DNA u području gena koji nas zanima.
• Primeri koji su odžareni na DNK sekvence koji nisu točni podudaraju se ne žare na 72 stupnja, čime ograničavaju izduženje na gen koji nas zanima.

Ovaj se postupak denaturiranja, žarenja i produženja ponavlja u više (30-40) puta, eksponencijalno povećavajući broj kopija željenog gena u smjesi. Iako bi taj postupak bio prilično naporan ako se izvodi ručno, uzorci se mogu pripremiti i inkubirati u a Programirajući termocikler, koji je danas uobičajen u većini molekularnih laboratorija, i u njemu se može provesti kompletna PCR reakcija 3-4 sata.

Svaki korak denaturiranja zaustavlja postupak elongacije iz prethodnog ciklusa, pri tome obrezivanje novog lanca DNA i zadržavanje približno do veličine željenog gena. Trajanje ciklusa izduženja može se produžiti ili kraće, ovisno o veličini gena koji nas zanima, ali na kraju, kroz ponovljene cikluse PCR, većina predložaka bit će ograničena samo na veličinu gena koji nas zanima, jer će biti stvoreni iz proizvoda obaju primera.

Postoji nekoliko različitih faktori uspješne PCR kojom se može manipulirati za poboljšanje rezultata. Najčešće korištena metoda za ispitivanje prisutnosti PCR proizvoda je elektroforeza agaroznog gela. Koji se koristi za odvajanje fragmenata DNA na temelju veličine i naboja. Fragmenti se zatim vizualiziraju pomoću boja ili radioizotopa.

Od otkrića PCR-a otkrivene su DNK polimeraze koje nisu originalni Taq. Neki od njih imaju bolju sposobnost "lektoriranja" ili su stabilniji na višim temperaturama, poboljšavajući tako specifičnost PCR-a i smanjujući pogreške zbog umetanja pogrešnog dNTP-a.

Neke varijacije PCR-a dizajnirane su za specifične primjene te se sada redovito koriste u molekularno-genetskim laboratorijima. Neki od njih su PCR u stvarnom vremenu i PC-povratna transkriptaza. Otkriće PCR također je dovelo do razvoja sekvence DNA, DNK otisci prstiju i druge molekularne tehnike.