Metode pročišćavanja proteina u biotehnologiji

Važna komponenta biotehnoloških istraživanja je uporaba tehnika inženjerskih proteina za dizajn ili izmjenu proteina. Ove tehnike pročišćavanja proteina optimiziraju svojstva proteina za specifične industrijske primjene.

Ove tehnike zahtijevaju od znanstvenika da izoliraju i pročišćavaju proteine ​​od interesa kako bi se proučavale njihove konformacije i specifičnosti supstrata. Također su potrebne studije reakcije s drugim ligandima (protein koji se veže za protein receptora) i specifične aktivnosti enzima.

Stupanj čistoće proteina koji je potreban ovisi o namjeravanoj krajnjoj upotrebi proteina. Za neke primjene dovoljan je sirovi ekstrakt. Druge namjene, poput hrane i lijekova, zahtijevaju visoku razinu čistoće. Nekoliko tehnika za pročišćavanje proteina koriste se za postizanje potrebne razine čistoće.

Svaki korak pročišćavanja proteina obično rezultira nekim stupnjem gubitka proizvoda. Stoga je idealna strategija pročišćavanja proteina ona u kojoj se postiže najviša razina pročišćavanja u najmanje koraka.

Odabir koraka za korištenje ovisi o veličini, naboju, topljivosti i drugim svojstvima ciljanog proteina. Sljedeće tehnike su najprikladnije za pročišćavanje jednog citosolnog proteina.

Pročišćavanje kompleksa citosolnih proteina je složenije i obično zahtijeva primjenu različitih metoda.

Prvi korak u pročišćavanju unutarćelijskih (unutar ćelije) proteina je priprema sirovog ekstrakta. Ekstrakt će sadržavati složenu mješavinu svih proteina iz stanične citoplazme, te nekih dodatnih makromolekula, kofaktora i hranjivih sastojaka.

Ovaj sirovi ekstrakt može se koristiti za neke primjene u biotehnologiji. Međutim, ako je pitanje čistoće potrebno je slijediti sljedeće korake pročišćavanja. Sirovi proteinski ekstrakti pripremaju se uklanjanjem staničnih krhotina nastalih lizijom stanica što se postiže upotrebom kemikalija, enzimi, soniciranje ili French Press.

Krhotine se uklone centrifugiranjem, a supernatant (tekućina iznad čvrstog ostatka) se obnovi. Sirovi preparati izvanstaničnih (izvan stanica) proteina mogu se dobiti jednostavnim uklanjanjem stanica centrifugiranjem.

Zasigurno biotehnologija Zahtjevi za termostabilnim enzimima - enzimima koji mogu podnijeti visoke temperature bez denaturiranja, zadržavajući visoku specifičnu aktivnost.

Organizmi koji stvaraju proteine ​​otporne na toplinu ponekad se nazivaju ekstremofili. Jednostavan pristup pročišćavanju proteina otpornog na toplinu je denaturiranje ostalih proteina u smjesi zagrijavanjem, a zatim hlađenjem otopine (čime se termostabilnom enzimu može reformirati ili ponovno razrijediti, ako potrebno). Denaturirani proteini mogu se zatim ukloniti centrifugiranjem.

moderan Biotech protokoli često koriste brojne komercijalno dostupne setove ili metode koji pružaju gotova rješenja za standardne postupke. Pročišćavanje proteina često se provodi pomoću filtera i pripremljenih stupaca za filtriranje gela.

Slijedite upute za dijalizu i dodajte pravu količinu ispravnog rješenja i pričekajte određeno vrijeme tijekom sakupljanja eluansa (otapalo je prošlo kroz kolonu) u svježem testu cijev.

Kromatografske metode mogu se primijeniti pomoću stolno-gornjih stupaca ili automatizirane HPLC opreme. Razdvajanje HPLC-om može se izvršiti obrnutim fazama, izmjenom iona ili isključenjem veličine, te uzorcima otkrivenim diodnim nizom ili laserskom tehnologijom.

U prošlosti je čest drugi korak pročišćavanja proteina iz sirovog ekstrakta bilo taloženjem u otopini visoke osmotske čvrstoće (tj. Otopine soli). Taloženje proteina obično se upotrebljava kao amonijev sulfat. Nukleinske kiseline iz sirovog ekstrakta mogu se ukloniti taloženjem agregata stvorenih streptomicin sulfatom ili protamin sulfatom.

Taloženje soli obično ne dovodi do visoko pročišćenog proteina, ali može pomoći u uklanjanju nekih neželjenih proteina u smjesi i koncentriranjem uzorka. Soli u otopini uklanjaju se dijalizom kroz poroznu celuloznu cijev, filtraciju ili kromatografijom za isključivanje gela.

Različiti proteini će se istaložiti u različitim koncentracijama amonijevog sulfata. Općenito, proteini veće molekularne težine talože se u nižim koncentracijama amonijevog sulfata.

Reverzno-fazna kromatografija (RPC) razdvaja proteine ​​na temelju njihove relativne hidrofobnosti (isključenje nepolarnih molekula iz vode). Ova je tehnika vrlo selektivna, ali zahtijeva uporabu organskih otapala.

Neki proteini se trajno denaturiraju otapalima i izgubit će funkcionalnost tijekom RPC-a. Stoga se ova metoda ne preporučuje u svim aplikacijama, posebno ako je potrebno da ciljni protein zadrži aktivnost.

Ionsko-izmjenjivačka kromatografija odnosi se na odvajanje proteina na temelju naboja. Stupci se mogu pripremiti za izmjenu aniona ili kation. Stupovi za izmjenu aniona sadrže stacionarnu fazu s pozitivnim nabojem koji privlači negativno nabijene proteine.

Stubovi kationske razmjene su obrnute, negativno nabijene kuglice koje privlače pozitivno nabijene proteine. Elucija (ekstrahiranje jednog materijala iz drugog) ciljnog proteina provodi se mijenjanjem pH u stupac, što rezultira promjenom ili neutralizacijom nabijenih funkcionalnih skupina svake protein.

Kromatografija za isključivanje veličine (poznata i pod nazivom gel filtracija) odvaja veće proteine ​​od manjih one jer veće molekule brže putuju kroz umreženi polimer u kromatografiji stupac. Veliki proteini se ne uklapaju u pore polimera, dok manji proteini prolaze duže vremena i prolaze kroz stupac kromatografije manje izravnim putem.

Eluat (rezultat elucije) sakuplja se u seriju epruveta koje razdvajaju proteine ​​na osnovu vremena elucije. Gel filtracija je koristan alat za koncentriranje uzorka proteina, jer se ciljni protein skuplja u manjem volumenu elucije nego što je u početku dodan u kolonu. Slične tehnike filtracije mogu se koristiti tijekom proizvodnje velikih proteina velikih količina zbog njihove isplativosti.

Afinitetna kromatografija vrlo je korisna tehnika "poliranja", odnosno dovršetka procesa pročišćavanja proteina. Zrnce u stupcu kromatografije umrežene su u ligande koji se specifično vežu na ciljni protein.

Zatim se protein ukloni sa kolone ispiranjem s otopinom koja sadrži slobodne ligande. Ova metoda daje najčišće rezultate i najveću specifičnu aktivnost u usporedbi s drugim tehnikama.

SDS-PAGE (natrijev dodecil sulfat upotrijebljen s elektroforezom poliakrilamidnog gela) veže se na proteine ​​dajući im velik neto negativan naboj. Budući da su naboji svih proteina prilično jednaki, ova metoda ih odvaja gotovo u potpunosti na temelju veličine.

SDS-PAGE se često koristi za testiranje čistoće proteina nakon svakog koraka u nizu. Kako se neželjeni proteini postupno uklanjaju iz smjese, broj traka vizualiziranih na SDS-PAGE gelu se smanjuje, sve dok ne postoji samo jedna traka koja predstavlja željeni protein.

Imunoblotting je tehnika vizualizacije proteina koja se primjenjuje u kombinaciji s afinitetnom kromatografijom. Antitijela za određeni protein upotrebljavaju se kao ligandi na stupcu afinitetne kromatografije.

Ciljni protein se zadržava na stupcu, zatim se uklanja ispiranjem kolone s otopinom soli ili drugim sredstvima. Antitijela povezana s radioaktivnim ili bojama pomažu u otkrivanju ciljnog proteina nakon što ih se odvoji od ostatka smjese.